尼康新一代N-STORM 超分辨顯微成像系統

與N-STORM相比，N-STORM 4.0的圖像采集速度提高了10倍，使得活細胞納米級分辨率圖像的拍攝成為了可能。2015年3月15日，N-STORM 4.0在德國哥廷根的“聚焦顯微鏡”會議上首次亮相，并于3月底正式上市。
自從2010 年N-STORM發布以來，尼康在超分辨顯微鏡領域一直處于領先地位。N-STORM基于由哈佛大學霍華德休斯醫學研究所莊小威博士開發的隨機光學重構顯微技術，其原理是通過熒光分子的閃爍，暫時分離出單個的熒光分子并對其進行精確定位，從而重構出納米級分辨率的圖像（分辨率是傳統光學顯微鏡的10倍）。N-STORM 4.0作為N-STORM 的升級產品，實現了活細胞動態過程的超分辨成像。
2014年的諾貝爾化學獎授予了超分辨顯微鏡領域，這證明超分辨顯微鏡技術正得到越來越多的關注，與此同時，超分辨技術應用擴展的需求也在增加。最新的研究表明，基于隨機光學重構的超分辨技術實現了活細胞動態超分辨成像，前所未有的觀察到了細胞內結構的納米級動力學過程，如黏著斑1，網格蛋白小窩中的轉鐵蛋白簇2，線粒體和內質網等細胞器3。
N-STORM 4.0 實現了激光激發設計和sCMOS相機的升級，單張圖像的采集速率從分鐘級提高到秒極。另外，新系統在成像視野的選擇上提供了更高的靈活性，用戶可以選擇活細胞高速成像模式，或者選擇固定細胞的大視野成像模式，以適應不同的應用需求。

1 Shroff, H. et al., 2008, Nature Methods, 5 (5), p417-423.
2 Jones, S.A. et al., 2011, Nature Methods, 8 (6), p499-505.
3 Shim, S-H. et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci., 109, p13978-13983. 

 ? 主要特點

 |  納米級水平的動態超分辨成像

    新升級的光學和照明系統，完美匹配sCMOS相機。
    圖像采集速度比N-STORM提升近10倍，單張圖像拍攝時間從分鐘級提高到秒級。
    活細胞動態超分辨成像，分辨率比傳統光學顯微鏡提高10倍。

80umX80um（拍攝分辨率512X512），拍攝速度30Hz；

40umX40um（拍攝分辨率256X256），拍攝速度100Hz；

20umX20um(拍攝分辨率128X128)，拍攝速度500Hz。

  |  高質量的超分辨成像 

     新升級的照明放大鏡提高了激光的激發效率，使得單位面積的熒光分子密度增加。
     采集足夠數量熒光分子所需時間更短，圖像采集速度顯著提高。
     單位時間內采集到的熒光分子數更多，圖像清晰度顯著提高。

（左）用Alexa For For?647標記的微管用N-STORM 4.0成像（具有20秒采集時間）

（右）與常規的N-STORM系統（20秒采集時間）相同的樣品成像

* Alexa For是Telo Fisher科學公司的注冊商標。

 |   寬視野的超高分辨率成像

    新開發了成像系統中間變倍體，實現更大視野拍攝。
   80μm x 80μm大視野成像，成像區域是前一代N-STORM的4倍。

左：成像范圍寬4倍，80μm×80μm（寬視模式）      右：常規模型的成像面積，40μm×40μm

樣品：線粒體ToM20與AlEXA64 7結合

 |  多重漂移矯正機制

    1）自相關漂移矯正算法，可矯正XYZ三維方向上的位置漂移。

    2）以熒光小球或其他發光顆粒進行定位標記參照，進行三維方向上的漂移矯正。

 |  N-STORM成像物鏡

    HP (High Power) 物鏡與高功率激光相匹配，使熒光基團發生快速閃爍。
    改進軸向色差校正，提高多色熒光的3D成像精度。

CFI HP Apochromat TIRF 100x oil         CFI HP Plan Apochromat VC 100x oil

超分辨率熒光顯微鏡技術大大的超出了傳統光學顯微鏡的分辨率極限

    N-STORM是一種超分辨率數字顯微鏡系統的新技術，該技術將“隨機光學重構顯微術”（哈弗大學授權）與尼康的Eclipse Ti研究級倒置顯微鏡結合在了一起。N-STORM能夠顯著提高分辨率可達到傳統光學顯微鏡分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集納米級的二維或三維多光譜圖像，橫向分辨率接近20nm軸向分辨率也接近50nm。N-STORM將光學顯微鏡的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。

遠大于傳統光學顯微鏡的分辨率

與傳統熒光顯微鏡不同，STORM并沒有在同一時間觀察樣品中所有的熒光標記分子，在某一時間點她只是激活其中的一小部分。重復這一過程可獲得多張圖像，在這些圖像中分子以納米的精度定位，組合這些圖像將最終重構出超級的分辨率。

 通過重疊單分子圖像構建超分辨率的影像

“STORM”這一新技術是通過多次曝光進而運算得到熒光團的高精度定位信息，通過整合這些信息而重構出高分辨率的熒光圖像（2D或3D）。這一技術可獲得更多豐富的細節信息，并更進一步使對樣品的理解從結構水平進化到分子水平。

 以超高的分辨率獲取三維信息

“STORM”技術通過多次曝光可運算得到熒光團高精度的Z軸定位信息，對這些信息進行重構即可獲得納米級分辨率的熒光3D圖像。正如單個分子可在x-y的維度中被定位一樣，N-STORM的3D組件同樣可在Z軸中確定單個分子的位置從而獲得高精度的3D超分辨率圖像。

 獨特的多色彩技術

采用不同有機染料的混合物可以實現多色彩的成像。這些染料是一種獨特的可以通過短波長激光活化而發光的熒光探針，通過不同波長的激光激發而成為彩色圖像：起始時這類探針處于非活化的狀態，隨后他們由一特殊波長的激發光激發而產生熒光。這一過程可使各個熒光團分別發光，從而相互區分開來，進而多次捕獲的圖像可以經過編輯成為最終具有超高分辨率的圖像。

 簡單，靈活的配置

尼康已有的標準硬件配置讓N-STORM能最大程度的使用戶獲益。這也意味著超分辨率的能力可以添加到領導市場的尼康Ti-E倒置顯微鏡上面或者是新出品的A1R共聚焦顯微鏡系統上面使用，N-STORM可輕易的配合已有產品搭建多功能的系統